スルフォラファンとは何ですか? | エルパソ、テキサス州カイロプラクティック医師
エルパソのカイロプラクター、アレックス・ヒメネス博士
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スルフォラファンとは何ですか?

スルフォラファン ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、およびブリュッセルの芽などの十字架の野菜に見られる有機硫黄化合物のイソチオシアネート基内の物質である植物化学物質です。 ボクチョイ、ケール、コラード、マスタードグリーン、クレソンでも見られます。 研究の結果、スルフォラファンは様々なタイプの癌を予防するのに役立つことが示されています。 Nrf2の生産を活性化する、または核因子赤血球2関連因子であり、酸化因子に対する細胞の応答を制御する防御的な抗酸化機構を調節する転写因子である。 次の記事の目的は、スルフォラファンの機能を説明することです。

抽象

KEAP1-Nrf2-ARE抗酸化系は、細胞が酸化ストレスおよび生体異物ストレスに応答する主要な手段です。 アブラナ科野菜由来の求電子性イソチオシアネートであるSulforaphane(SFN)はKEAP1-Nrf2-ARE経路を活性化し、慢性的な酸化ストレスが主要な病因的役割を果たす疾患の治療に関心を集めています。 我々は、SFNで処理した培養ヒト網膜色素上皮(RPE-1)細胞のミトコンドリアが、Nrf2およびその細胞質インヒビターKEAP1の両方から独立した過剰融合を受けることをここに実証する。 ミトコンドリア融合は、アポトーシス中のミトコンドリアにおける孔形成を阻害することによって細胞保護的であることが報告されており、これと一致して、アポトーシス誘導物質であるスタウロスポリンに曝露されたSFN処理細胞のNrf2非依存性細胞防御を示す。 メカニズム的には、SFNは可溶性核分裂因子Drp1のミトコンドリアおよびペルオキシソームへの動員および/または保持を軽減するが、全体のDrp1存在量には影響しない。 これらのデータは、SFNの有益な特性がKEAP1-Nrf2-AREシステムの活性化を超えて広がり、複数の臨床試験においてこの薬剤の現在の使用を考慮すると、さらなる尋問が必要であることを実証している。

キーワード: スルフォラファン、Nrf2、Drp1、ミトコンドリア、核分裂、融合、アポトーシス

概要

スルフォラファンは、ミトコンドリア核分裂のNrf2非依存性インヒビターである

Sulforaphane(SFN)は、十字架野菜[56]から最も一般的に摂取されるイソチオシアネート化合物です。 これは、損傷細胞からの加水分解酵素ミロシナーゼの小胞放出を介した捕食に対する生体異物応答として植物において生成される; この酵素はグルコシノレートをイソチオシアネート[42]に変換する。 過去20年間に、SFNは報告された抗癌剤、抗酸化剤、および抗菌剤の特性[57]のために広範に特徴付けられました。 ヒストンデアセチラーゼ活性および細胞周期進行の阻害を含む、化合物のさらなる活性が同定されているが、この有効性の多くは、SFNがKEAP1-Nrf2-抗酸化応答エレメント(ARE)シグナル伝達経路を調節する能力に起因する29]。 Nrf2は、恒常性の条件下で、マスター酸化防止転写因子であり、その安定性は、細胞質のCullin3KEAP1ユビキチンリガーゼ複合体[20]の作用によって抑制される。 具体的には、Nrf2は、二量体基質アダプターKEAP3に結合することによってCullin1KEAP1リガーゼに補充され、続いて、プロテアソーム媒介分解のための転写因子を標的とするポリUb鎖で修飾される。 この構成的代謝回転は、ストレスのない細胞におけるNrf2の半減期を〜15分[30]、[33]、[46]、[55]に制限する。 KEAP1の重要なシステイン、特にC151の酸化修飾はCoxNUMXからNrf1-KEAP2を解離させ、それによってNrf1の分解を防止することが知られている[ 3]、[2]、[8]。 特に、SFN、および恐らく他のNrf20アクチベーターは、KEAP55のC2(例えば、[151])を改変することによって酸化的ストレスを模倣する。 Nrf1の安定化は核へのその移行を可能にし、そこで第II相の抗酸化物質および解毒遺伝子の細胞の発現を誘導する。 Nrf21は、小さなMafタンパク質[2]とのヘテロ二量体化を介して、その同種標的遺伝子の抗酸化応答応答エレメント(ARE)に結合する。 このシステムは、SFNのような間接的な抗酸化物質、ミトコンドリア[2]によって生成されたフリーラジカル、または酸化的ストレスの他の生理学的発生源[19]に対して、動的かつ感受性の高い応答を示す。

ミトコンドリアは、ATP産生および細胞内カルシウム緩衝からレドックス調節およびアポトーシス[13]、[49]に及ぶ細胞機能の宿主を調節する動的な細胞下オルガネラである。 ミトコンドリアはまた、細胞内の活性酸素種(ROS)の主要な供給源でもある。 したがって、ミトコンドリア機能の適切な調節は、過度のフリーラジカル産生の潜在的有害作用を最小限に抑えながら、細胞の必要性を満たすようにATP産生を最適化するために必要である。 ミトコンドリア機能の細かい調節のための決定的な要件は、ミトコンドリアが生化学的な機械としても広大な応答性のあるネットワークの一部としても独立して機能する能力である。

ミトコンドリアのネットワーク形態および機能は、分裂と融合との間の調節されたバランスによって決定される。 ミトコンドリア核分裂は、分裂中のミトコンドリアの娘細胞の遺伝[28]ならびに脱分極または損傷したミトコンドリアの選択的、自食性分解(mitophagy [1]と称される)のために必要である。 逆に、ミトコンドリアゲノムの相補および隣接ミトコンドリア間の電子輸送鎖成分の共有には、融合が必要である[54]。 分子レベルで、ミトコンドリア分裂および融合は、大きな、ダイナミン様のGTPアーゼによって調節される。 ミトコシン1および2(Mfn1 / 2)は、隣接ミトコンドリア[15]、[25]、[37]間の異型相互作用を介して外膜融合を媒介する2パス外膜タンパク質であり、OPA1は内在内部膜[5]の融合を調節することによってマトリックスの連結性を同時に保証する膜タンパク質。 強力な融合[5]、[18]、およびOPA1はプロテアーゼOMA1 [14]、PARL [6]、およびYME1L [45]によってミトコンドリア内膜内の複合タンパク質分解によってさらに調節される]。 重要なことに、損なわれた健康なミトコンドリアの統合を抑制するために、無傷のミトコンドリア膜電位が効率的な融合に必要である[26]。

ミトコンドリア分裂は、主にダイナミン関連タンパク質1(Drp1 / DNM1L)と呼ばれる細胞質ゾルタンパク質によって触媒される。 Drp1は、ミトコンドリア外膜[43]上の分裂の予定部位に細胞質ゾルから補充される。 外膜上のDrp1の主受容体は、ミトコンドリア分裂因子(Mff)[32]であり、程度は低いが、Fission1(Fis1)[51]である。 さらに、潜在的な核分裂部位[1]でのDrp51タンパク質の活性をさらに制限する作用をするデコイ受容体MIEF1 / MiD58が発見された。 ミトコンドリア外膜にドッキングすると、Drp1はミトコンドリアの体の周りのらせん状構造にオリゴマー化し、次にミトコンドリア外膜および内膜[17]の物理的切断を媒介するためにGTP加水分解由来のエネルギーを利用する。 小胞体由来細管は、非限定ミトコンドリアが完成したDrp1らせん体[1]の許容円周より広いという啓示を強調して、Drp12オリゴマー化の前にミトコンドリアの初期狭窄因子として働く。 アクチン力学は、ミトコンドリア分裂に先立つER-ミトコンドリア相互作用[24]にとっても重要である。 Drp1は、ミトコンドリア分裂におけるその役割に加えて、ペルオキシソーム[40]の分裂を触媒する。

Drp1は、両方のタンパク質がN末端GTPaseドメイン、自己オリゴマー化に重要な中間ドメイン、およびC末端GTPaseエフェクタードメイン[31]を含む点で、十分に特徴付けられたダイナミンタンパク質と非常に類似している。 Drp1は、その受容体タンパク質MffおよびFis1との相互作用およびDrp1 [2]の独特のB-挿入ドメインを介したミトコンドリア特異的リン脂質カルジオリピンに対するその親和性を介して、ミトコンドリア膜の選択性を達成する。 Drp1は、典型的には細胞質中のホモ四量体として存在し、ミトコンドリア核分裂部位でのより高次の集合は、Drp1 [3]の中領域によって媒介される。

ミトコンドリア機能とKEAP1-Nrf2-ARE経路との間の暗黙のつながりを考えると、我々は、ミトコンドリア構造および機能に対するNrf2活性化の効果を調べた。 私たちは、SFNが予期せず、Nrf2とKEAP1の両方に依存しないミトコンドリアの過剰融合を誘導することをここで実証する。 SFNのこの効果は、Drp1機能の阻害によるものである。 我々はさらに、SFNがNrf2非依存性のアポトーシスに対する抵抗性を付与し、Drp1が枯渇した細胞で観察されるものを模倣することを示す。 これらのデータは、Nrf2を安定化および活性化することに加えて、ミトコンドリア動態を調節し、細胞の適応および生存を維持することを集合的に示す。

成果

SulforaphaneはMのNrf2 / KEAP1に依存しない過融合を誘導するイトコンドリア

Nrf2活性化がミトコンドリアネットワークのダイナミクスに及ぼす影響を研究する過程で、Nrf1シグナル伝達の強力な活性化剤であるスルフォラファン(SFN)による不死化ヒト網膜色素上皮(RPE-2)細胞の治療が、ビヒクル処理対照細胞(図1AおよびB)と比較した場合のミトコンドリアネットワーク。 これらの細胞におけるミトコンドリアの形態は、主要なミトコンドリア分裂因子である内因性Drp1のsiRNAによって枯渇した細胞におけるミトコンドリアの形態と非常に似ていた(図1A)。 この結果は、ミトコンドリア分裂および融合状態が細胞内のNrf2レベルに直接応答するという興味深い考えを提起した。 しかし、プロテアソーム阻害剤MG2、プロオキシダントtBHQ、またはNrf132阻害剤KEAP2のノックダウンなどの他のNrf1安定化剤および活性化剤による細胞の刺激は、ミトコンドリア融合を誘発しなかった(図1AおよびB)。 これらの操作によるNrf2の安定化は、内因性Nrf2(図1C)のウエスタンブロッティングによって確認した。 さらに、siRNAによる内因性Nrf2のノックダウンはこの表現型に対抗できなかったため、SFN誘導ミトコンドリア融合についてはNrf2の発現は不可能であった(図1D-F)。 SFNは、KEAP1 [2]のシステイン残基を共有結合的に改変することによりKEAP1-Nrf21-ARE経路を刺激するため、KEAP1依存型経路を介してSFN誘導性ミトコンドリア過融合が刺激されるかどうかを調べるためにKEAP1をノックダウンした。 しかし、KEAP2の枯渇は、SFN誘発ミトコンドリア融合を排除することもできなかった(図1G-I)。 実際、SFNは、KEAP1の枯渇によって誘導される分裂形態の形態を逆転させた(図1G、パネルb対パネルd)。 これらの結果は、SFN処理が、カノニカルなKEAP1-Nrf1-ARE経路とは独立したミトコンドリア融合を引き起こし、SFNがミトコンドリア分裂または融合機構の成分に直接影響を与えるかどうかを調べるように導いた。

図1 SFNは、Nrf2 / KEAP1非依存性ミトコンドリア融合を誘導する。 (A)示されたsiRNAでRPE-1細胞をトランスフェクトし、3の場合、DMSOまたはNrf2活性化因子SFN(50μM)、MG132(10μM)またはtBHQ(100μM) ミトコンドリア(赤色)を抗Tom4抗体で標識し、核(青色)をDAPIで対比染色する。 (B)(A)から採点したミトコンドリア形態の定量を示すグラフ。 >条件ごとの20細胞を盲検法で評価した。 (C)(A)からの代表的なウエスタンブロット。 (D)RPE-50細胞を1 nM siRNAでトランスフェクトし、10日後に3 hでSFNで処理した後、(A)と同様に固定および染色した。 (E)(D)からのミトコンドリア表現型の採点の定量を示すグラフ。 >条件ごとの4細胞を盲検法で評価した。 (F)(D)の代表的なウエスタンブロット。 (G)細胞をトランスフェクトし、siCONまたはsiKEAP100で(D)と同様に処理した。 (H)ミトコンドリア形態に基づいて、(G)からの細胞を(B)および(E)と同様に採点した。 (I)(G)の代表的なウェスタンブロット。 (B)、(E)および(H)のデータは、それぞれ1独立実験から集められ、両側スチューデントのt検定によって統計的有意性が決定された。 エラーバーは+/- SDを反映しています(この図の凡例の色の解釈については、この記事のWeb版を参照してください)。

SulforaphaneはDrp1のミトコンドリア協会を損なう

SFN治療がミトコンドリア過融合を誘導するという知見に基づいて、我々はこの表現型が過度の融合活性の結果であるか、または分裂活性の阻害のいずれかであると推論した。 これら2つの可能性を区別するために、我々はSFNの存在下および非存在下でのペルオキシソームの形態を比較した。 ペルオキシソームは、形状と長さが常に流動している動的オルガネラであるという点でミトコンドリアに似ている[44]。 ペルオキシソームは、外膜にFis1およびMffの両方を含み、結果として、Drp1媒介分裂[22]、[23]の標的である。 しかしながら、ペルオキシソームは、ミトコンドリアネットワークの融合機構を利用しないため、融合[39]を受けない。 むしろ、ペルオキシソーム分裂は、膜およびタンパク質の新たな添加[44]を介した既存のペルオキシソームの延長によって反対されている。 ペルオキシソームはMfn1 / 2とOPA1が欠けているので、SFNが核分裂機構を阻害するのではなく融合機構を活性化すれば、ペルオキシソームの長さに影響はないと推論した。 ビヒクルで処理した細胞では、ペルオキシソームは、短く、丸く、点状のオルガネラとして維持される(図2、パネルbおよびd)。 しかし、SFN処理は、対照細胞と比較して〜2倍のペルオキシソーム長を増加させた(図2、パネルfおよびh)。 さらに、ペルオキシソームの多くは中心近くに挟まれ、潜在的な切断欠陥を示した(図2、パネルh、矢頭)。 同様に、Drp1 siRNAでトランスフェクトされた細胞のペルオキシソームは異常に長く(図2、パネルjおよびパネル1)、Drp1がペルオキシソーム分裂に必要であり、SFN処理がミトコンドリアおよびペルオキシソーム表現型を分裂機序を破壊することを示唆している。

図2 SFNはペルオキシソーム伸長を誘導する。 (A)示されたsiRNAの1 nMでRPE-10細胞をトランスフェクションし、後に3に対してDMSOまたは50μMSFNで処理した4日をトランスフェクトした。 ペルオキシソーム(緑色)を抗PMP70抗体、ミトコンドリア(MitoTracker)(赤色)で標識し、DNAをDAPIで対比染色した。 SFNおよびDrp1枯渇によって誘導される形態の変化の視覚化を容易にするために、ペルオキシソームの拡大した挿入が右側(パネルd、hおよびl)に示されている。 矢頭は狭さくポイントを強調表示します。 (この図の凡例の色の参照の解釈については、この記事のWeb版を参照してください)。

次に、SFNがDrp1機能をどのように制限するかを決定しました。 可能性としては、発現レベルの低下、ミトコンドリアでの補充/保持、オリゴマー化、またはGTPアーゼの酵素活性が挙げられた。 これらのいずれかが欠損すると、ミトコンドリア分裂および過融合が減少する。 我々は、SFN処理後のDrp1タンパク質レベルの再現性のある変化を検出しなかった(図1Cおよび3A), 従って、SFNは、> 1 h [1]の半減期を有するDrp10と一致して、DrP50の安定性又は発現を変化させず、SFN治療はより短期間であると結論付けた。 次に、SFNがミトコンドリアへのDrp1の動員または保持に影響を与えるかどうかを調べた。 分画研究は、SFNがミトコンドリア画分からのDrp1の喪失を誘導したことを示した(図3A、レーン7-8および図3B)。 以前に報告されたように[43]、Drp1(〜3%)のわずかな部分のみが、ミトコンドリアネットワークと関連している 定常状態 ほとんどの酵素が細胞質に存在する状態(図3A、レーン5-8)。 これらの分画データは、SFN処理後にミトコンドリアに局在した、点状のDrp40フォーカスの〜1%の減少を示す共局在分析を用いて確認した(図3CおよびD)。 まとめると、これらのデータは、SFNによって誘導されたミトコンドリア融合が、少なくとも部分的に、Drp1とミトコンドリアとの弱い会合に起因することを示している。 我々のデータは、内因性Drp1の分析が生細胞顕微鏡法によるGTPaseの可視化に適していないため、SFNがミトコンドリア動員とDrp1のミトコンドリア保持、またはその両方を妨げるかどうかを区別しない。

図3 SFNは、ミトコンドリアからのDrp1の喪失を引き起こす。 (A)DMSOまたはSFNの1後のRPE-4細胞の細胞下分画。 全細胞溶解物(WCL)、核(Nuc)、細胞質ゾル(Cyto)および粗ミトコンドリア(Mito)画分をSDS-PAGEにより分離し、指示された抗体でウエスタンブロッティング処理した。 分子量マーカーの移動は左側に示されている。 (B)(A)からの示された画分におけるDrp1の濃度測定を示すグラフ。 (C)RNXX細胞を1 nM siCONまたはsiDrp10でトランスフェクトし、1日後に3でDMSOまたはSFNで処理した。 Drp4(緑色)を抗Drp1抗体、MitoTracker(赤色)を有するミトコンドリア、およびDAPI(青色)を有する核で視覚化した。 (D)(C)からのDrp1およびMitoTrackerシグナルの自動共局在分析。 (B)および(D)のデータは、それぞれ1および3の独立した実験から集められ、両側スチューデントのt検定によって統計的有意性が決定された。 エラーバーは+/- SDを反映し、アスタリスクは統計的有意性を示す。 (この図の凡例の色の参照の解釈については、この記事のWeb版を参照してください)。

SulforaphaneはStaurosportine誘発アポトーシスに対する保護を与えるNrf2とは独立して

以前の研究は、ミトコンドリア分裂が、アポトーシス中にBax / Bakによって生成された外側のミトコンドリア膜の孔の形成において許容されることを示した[11]。 Drp1は、アポトーシス[11]の間に選択的にミトコンドリアに補充されることが示されており、これと一致して、断片化したミトコンドリアはプロセス[27]の初期に観察されている。 逆に、ミトコンドリア分裂を阻害することは、シトクロムc放出を可能にする外膜孔の形成をブロックすることによってアポトーシスを阻害すると考えられている[53]。 したがって、ミトコンドリア融合の刺激は、スタウロスポリン(STS)[14]を含む化合物によって誘導されるアポトーシスの進行を遅延させる。 SFNがSTS媒介性アポトーシスからRPE-1細胞を保護するか否かを決定するために、Nrf2が必要かどうかを確認するために、活性化カスパーゼ-3の基質であるポリADPリボースポリメラーゼ(PARP) 決定的な アポトーシスのマーカー。 1 hに対する1μMSTSを用いたRPE-6細胞の処理は、PARNの非常に適度な切断を引き起こしたに過ぎなかったが、これはSFN同時処理(例えば、図4A、3対レーン4)によって妨げられた。 このアッセイの堅牢性を高めるために、本発明者らは、抗アポトーシス因子Bcl-XLを標的とするsiRNAで細胞を前処理することにより、細胞をSTS誘発アポトーシスに対してさらに感作させた。 この前処理は、STSに曝露された時間の関数としてBcl-XLの発現を顕著に促進し、PARP開裂を促進した(図4B、レーン2とレーン4-10を比較)。 重要なことに、SFNによる前処理の2 hは、STSに曝露された細胞におけるPARP切断を緩和した(図4C、3対4および5対6レーン)。 同様に、CRISPR / Cas2によるNrf9の安定的に枯渇した細胞は、SFN前処理(図4C、レーン11対12およびレーン13対14および図4D)によってSTS毒性から同等に保護された。 この保護は、PARP切断(図4CおよびD)および細胞形態(図4E)の両方を読み出し値として用いて観察された。 CRISPR / Cas2によるNrf9枯渇の有効性は、ウェスタンブロッティングによって確認した(図4C、Nrf2ブロット)。 予測されるように、SFN(図1FおよびG)と共にインキュベートした対照細胞と比較して、過剰融合表現型(図1A)をももたらすDrp4の細胞を枯渇させることにより、STSに応答するPARP切断も遮断された。 これらの知見は、Nrf1の安定化および活性化とは無関係に、SFNがDrp2機能を制限する能力を介してアポトーシスに対する防御を与えることと一致する。

図4 SFNの細胞保護効果は、DMSO、2μMスタウロスポリン(STS)、または1μMエトポシドで処理する前に、50 hについてDMSOまたは2μMSFNで前処理した(A)RPE-1細胞をNrf50発現6 hで処理し、抗PARPウェスタンブロッティングのために処理した。 (B)1、2.5または1の場合、RPE-2.5細胞を3 nM siCON、1 nM siBcl-XL、または2 nM siBcl-XLでトランスフェクトし、4日後にDMSOまたは6μMSTSで処理した。 代表的なウェスタンブロットが示され、分子量マーカーの移動が左側に示されている。 (C)CRISPR / Cas9生成野生型(Nrf2WT)およびNrf2ノックアウト(Nrf2KO)RPE-1細胞を1nM siBcl-XLでトランスフェクトし、3日後に50に対してDMSOまたは2μMSFNで前処理した。 続いて、細胞を1、2または4の6μMSTSで処理した。 示された抗体を有する代表的なウエスタンブロットを示す。 (D)3の独立した実験から全PARP(切断+非切断)のパーセンテージとしての切断されたPARPの定量。 重要なことに、切断されたPARPのレベルは、細胞がNrf2を発現したか否かにかかわらず、STSからのSFN保護が転写因子とは無関係であることを示していた。 (E)20X位相差画像は、(C)からの溶解物を採取する直前に採取した。 スケールバー= 65μm。 (F)Drp1の枯渇がSFN治療とほぼ同等のSTSからの保護を与えることを示す代表的なウェスタンブロット。 RPE-1細胞を1 nM siBcl-XLでトランスフェクトし、さらに10 nM siCONまたは10 nM siDrp1でトランスフェクトした。 3日後、siCON細胞を(A)および(C)のようにSFNで前処理し、次に4 hでSTSに曝露してから回収し、指示された抗体でウェスタンブロッティングを行った。 (G)3の独立した実験から(F)で提示したデータの(D)と同じ。 エラーバーは+/- SEMを反映する

議論

我々は、SFNがKEAP1-Nrf2-ARE経路に対するその効果とは無関係に、ミトコンドリア分裂/融合ダイナミクスを調節することを発見した。 これは、ミトコンドリア機能不全とROS産生との間の仮定された関連性、およびNrf2の活性化によるミトコンドリア由来のフリーラジカルのスケルチングの必要性のために興味深い。 前立腺癌、閉塞性肺疾患、および鎌状赤血球症[30]、[7]、および鎌状赤血球症を含む様々な疾患の治療のためのSFNの検査を現在進行中の10臨床試験を考慮すると、SFNのこのさらなる機能的影響は、 47]。

SFNはイソチオシアネート[56]であり、重要なKEAP2システインを直接的にアシル化することによりNrf1シグナル伝達を活性化してNrf2分解[21]を抑制するので、SFNはシステイン修飾による分裂または融合因子の活性を調節する。 我々のデータは、GTPaseがアシル化の直接的な標的であるかどうかはまだ解明されていないが、Drp1がSFNによって負に調節されることを強く支持している。 この知識のギャップにもかかわらず、Drp1の機能は、ミトコンドリアおよびペルオキシソームの両方がSFNによって明らかに損なわれている 過融合 SFN治療に応答して、これらのオルガネラは、それぞれの切断事象[1]についてDrp38を共有する。 さらに、SFNは、ミトコンドリアで局在し、蓄積するDrp1の量を減少させる(図3)。 我々の実験はすべての内在性タンパク質を用いて行われたため、ミトコンドリア分裂部位でのDrp1の検出は定常状態であり、その結果、SFNに起因する酵素の補充と保持欠損とを区別することができない。 さらに、SFNがミトコンドリア(Fis1またはMff)で受容体をアシル化し、Drp1の動員をブロックする可能性を排除することはできません。我々はDrp1が直接修飾されていると考えています。 Drp1は9つのシステインを有し、そのうち8つはオリゴマー化[3]に必要な中間ドメイン内に存在し、その1つはDrp1のC末端のGTPaseエフェクタードメイン(GED)に存在する。 これらのシステインのいずれかの直接アシル化はDrp1の活性欠損を引き起こし、したがってミトコンドリア動力学に対するSFNの効果の基礎となりうる。 注目すべきことに、以前の研究は、オリゴマー化および触媒活性の欠陥が、ミトコンドリア[1]でのDrp52の保持を無効にすることができることを示唆している。 GDドメインのCys644は、Drp1 GTPase活性[4]を損ない、このシステインがチオール反応性求電子剤[9]によって修飾されているこのシステイン表現型突然変異の変異を示す以前の研究に基づいて特に魅力的な標的である。 この未解決の問題の解決には、質量分析の検証が必要です。に 要約すると、本発明者らは、臨床的に関連する化合物SFNの新規な細胞保護的機能を同定した。 SFNは、マスター抗酸化転写因子Nrf2を活性化することに加えて、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム融合を促進し、この効果はNrf2とは無関係である。 この現象の根底にあるメカニズムは、ミトコンドリアおよびペルオキシソーム分裂の主要メディエーターであるGTPアーゼDrp1の機能の低下を伴う。 SFN媒介性ミトコンドリア融合の主な結果は、細胞がアポトーシス誘導剤スタウロスポリンの毒性作用に対して抵抗性になることである。 SFNのこの追加の細胞保護作用は、これらの疾患がアポトーシスと関連しており、減少した(例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、加齢性黄斑変性などの)主要な危険因子である多数の神経変性疾患において、 Nrf2 [35]、[36]、[48]のレベルおよび/または調節不全を含む。 まとめると、これらのデータは、SFNの細胞保護特性がKEAP1-Nrf2-AREシステムの活性化を超えて広がり、複数の臨床試験におけるこの薬剤の現在の使用を考慮すると、さらなる研究を保証することを実証する.

マテリアルとM倫理

アポトーシスアッセイ

細胞を播種し、以下に示すようにsiRNAでトランスフェクトした。 細胞を50のために2μMスルフォラファンで前処理してミトコンドリア融合を誘導し、次いで1μMスタウロスポリンで処理してアポトーシスを誘導した。 収穫時に、培地を個々の試験管に集め、高速遠心分離に付してアポトーシス細胞をペレット化した。 この細胞ペレットを接着細胞と混合し、2倍濃縮Laemmli緩衝液に可溶化した。 試料を抗PARPウェスタンブロットに供した。

CRISPR / Cas9コンストラクトの生成

LentiCRISPR / eCas9 1.1を作成するには、LentiCRISPR v2(addgene#52961)をAge1とBamH1で最初にカットしました。 次に、以下のプライマー(フォワードAGCGCACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGACTATAAGGACCACGAC、逆方向AAGCGCGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGG)を用いて、Age9およびBamH9オーバーハングを用いて、eSpCas1.171814(付加遺伝子#1)からのSpCas1をPCR増幅し、上記カットベクターに連結した。 Benchling.comを用いてsgRNA配列を決定した。 最も高いオンターゲットおよび最も低いオフターゲットスコアを有するコード配列を標的とするようにパラメーターを設定した。 アニールしBsmB2はLentiCRISPR / eCas2 1カットに連結した、以下の配列(; HS sgNFE2L2#2センスCACCGGTTTCTGACTGGATGTGCT、アンチセンスAAACAGCACATCCAGTCAGAAACC HS sgNFE2L2#3センスCACCGGAGTAGTTGGCAGATCCAC、アンチセンスAAACGTGGATCTGCCAACTACTCC標的配列に下線は、sgNFE1L9#1.1センスCACCGCGACGGAAAGAGTATGAGC、アンチAAACGCTCATACTCTTTCCGTCGCをHS)。 レンチウイルス感染したRPE-1細胞をピューロマイシンで選択し、プールされた集団として維持した。 ノックアウトは、免疫蛍光およびウエスタンブロッティングによって確認した。

細胞培養およびトランスフェクション

テロメラーゼ(RPE-1)(ATCC)で形質転換したヒト網膜色素上皮細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン、1X非必須アミノ酸カクテル(Life Technologies)を補充した1 g / Lグルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)および10%ウシ胎仔血清(Life Technologies)を含む。 siRNAトランスフェクションのために、30,000-35,000細胞/ mLを一晩播種した。 細胞は、無血清DMEMで希釈し、10%インターフェロントランスフェクション試薬(PolyPlus)と組み合わせた0.3 nM siRNAを受けた。 アポトーシス感作のために、細胞に1 nM Bcl-XL siRNAを与えた。 トランスフェクション後、細胞を2-3日後に採取した。

化学物質、抗体、siRNAオリゴ

(細胞シグナル伝達)、β-チューブリン(シグマ)、Drp1(BDバイオサイエンス)、KEAP1(プロテインテック)、ラミンB1(Abcam)、PARP(Cell Signaling)、PMP70(Abcam)およびTom20(BD Biosciences )をウエスタンブロッティングおよび免疫蛍光のための1:1000希釈液で使用した。 社内では、抗Nrf2ウサギ抗体をウェスタンブロッティング[1]、[2000]のために34:59で使用した。 Sulforaphane(Sigma)およびStaurosporine(Tocris)をそれぞれ50μMおよび1μMで用いた。 別段の記載がない限り、Drp1(Dharmacon)、Nrf2(Dharmacon)、KEAP1(Cell Signaling)およびBcl-XL(Cell Signaling)に対するsiRNAを使用した。

免疫蛍光およびインビボ標識

18 mmガラスカバースリップ上に播種した細胞をビヒクルまたは薬物で処理し、3.7%ホルムアルデヒドで固定し、次いで0.2分の氷上で100%Triton X-10 / PBSで透過処理した。 一次抗体をPBS中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)中、一晩4℃でインキュベートした。 PBS洗浄後、細胞を、1%BSA / PBS中で、種に適したAlexa488-またはAlexa546-結合二次抗体(希釈1:1000)および0.1μg/ mL DAPI(Sigma)中で3hでインキュベートした。 ミトコンドリアは、抗Tom20免疫蛍光法によって、または固定前に200℃で30分の無血清DMEM中の37 nM MitoTracker Red CMXRos(Molecular Probes、Inc.)中で細胞をインキュベートすることによって視覚化した。

顕微鏡と画像解析

免疫蛍光サンプルをLSM710共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)で観察した。 顕微鏡写真は、63Xまたは100X油浸対物レンズとAdobe Photoshop CS6を使用して調整した画像を使用して取得しました。 共局在分析は、カールツァイスLSM710共局在化特徴を用いて実施され、その閾値は手動で設定され、一方、サンプルの同一性は知らされなかった。 特に明記しない限り、全体を通してのスケールバーは10μmです。 ミトコンドリアの形態学は、盲検採点によって評価した。 ある細胞のミトコンドリアが複数回、丸く、穿刺を区別するように維持されていた場合、その細胞は「分裂」として採点された。 個々のミトコンドリアが区別できず、ミトコンドリア全体のネットワークが連続的に見える場合、細胞は「融合」として採点された。 ミトコンドリアをクラスター化しているものを含む他の全ての細胞は、「中間体」として採点された。

細胞外分画

RPE-1細胞をコンフルエントになるまで増殖させた。 PBS洗浄後、細胞を600×gで10分遠心し、600μL単離緩衝液(210 mMマンニトール、70 mMスクロース、5 mM MOPS、1 mM EDTA pH 7.4 + 1 mM PMSF)に再懸濁した。 懸濁液をDounceホモジナイザーで30回溶解した。 ホモジネートの画分を「全細胞溶解物」として保存した。残りを、800×gで10×gで遠心分離して核をペレット化した。 上清を1500×分で10×gで遠心分離に付して、残りの核および未溶解細胞を清澄化した。 この上清を15,000で15×gで遠心分離してミトコンドリアをペレット化した。 上清を「細胞質画分」として保存した。 ペレットをPBSで穏やかに洗浄し、単離緩衝液中に再懸濁した。 各画分のタンパク質濃度をビシンコニン酸(BCA)アッセイによって測定し、等量のタンパク質をSDS-PAGEにより分離した。

ウェスタンブロッティング

細胞をPBS中で洗浄し、2倍量のLaemmli可溶化緩衝液(100mMトリス[pH6.8]、2%SDS、0.008%ブロモフェノールブルー、2%2-メルカプトエタノール、26.3%グリセロールおよび0.001% Pyrinin Y)。 溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲルに負荷する前に、5 minで煮沸した。 タンパク質をニトロセルロース膜に移し、1%Milk / TBST中で5 hで膜をブロックした。 一次抗体を5%Milk / TBSTで希釈し、一晩4℃でブロットとインキュベートした。 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP) - コンジュゲート二次抗体を5%Milk / TBSTで希釈した。 ブロットを、化学発光を増強して処理し、濃度測定をImageJソフトウェアを用いて行った。

Dr Jimenez White Coat

スルフォラファンは、ブロッコリー、キャベツ、カリフラワー、ケールおよびコラードを含む、十字架の野菜から得られた有機硫黄物質のイソチオシアネート収集物からの化学物質である。 スルフォラファンは、酵素ミロシナーゼがグルコラノレートであるグルコラファファインをスルフォラファン(スルフォラファン - グルコシノレートとしても知られる)に変換すると生成される。 ブロッコリー芽およびカリフラワーは、グルコラファファインまたはスルフォラファンの前駆体の濃度が最も高い。 研究により、スルフォラファンは様々な健康問題を防ぐために人体の抗酸化能力を高めることが実証されています。

Dr. Alex Jimenez DC、CCST Insight

スルフォラファンと癌、死亡率、老化、脳と行動、心臓病などへの影響

イソチオシアネートはあなたの食生活で最も重要な植物化合物のいくつかです。 この ビデオ これまでに作られたものの中で最も包括的なケースを作ります。 短い注意期間? 以下のいずれかの時点をクリックして、お気に入りのトピックにスキップしてください。 フル 以下のタイムライン。

主要なセクション:

  • 00:01:14 - がんと死亡
  • 00:19:04 - エージング
  • 00:26:30 - 脳と行動
  • 00:38:06 - 最後の要約
  • 00:40:27 - 線量

フルタイムライン:

  • 00:00:34 - ビデオの主な焦点であるスルフォラファンの紹介。
  • 00:01:14 - 十字架植物の消費と全死亡率の低下。
  • 00:02:12 - 前立腺がんのリスク。
  • 00:02:23 - 膀胱がんのリスク。
  • 00:02:34 - 喫煙者のリスクのある肺癌。
  • 00:02 - 乳がんリスク。
  • 00:03:13 - 仮説:既にがんになったら? (介入)
  • 00:03:35 - 考えられるメカニズム駆動 死亡率連想データ。
  • 00:04:38 - スルフォラファンとがん。
  • 00:05:32 - 動物の証拠 強い ラットにおける膀胱腫瘍発生に及ぼすブロッコリー芽抽出物の効果
  • 00:06:06 - 前立腺癌患者におけるスルフォラファンの直接補充の効果。
  • 00:07:09 - 実際の乳房組織におけるイソチオシアネート代謝産物の生物濃縮。
  • 00:08:乳癌幹細胞の抑制。
  • 00:08:53 - ヒストリーレッスン:ブラシカは古代ローマでさえ健康的な特性を持つものとして確立されました。
  • 00:09:16 - Sulforaphaneの発癌性排泄を高める能力(ベンゼン、アクロレイン)。
  • 00:09:51 - NRF2は抗酸化物質を介して遺伝子スイッチとして働きます。
  • 00:10:10 - NRF2活性化がグルタチオン-S結合体を介して発癌物質の排出をどのように高めるか
  • 00:10:34 - Brussels sproutsはグルタチオン-S-トランスフェラーゼを増加させ、DNA損傷を減らします。
  • 00:11:20 - ブロッコリー発芽飲料はベンゼン排泄を61%増加させる。
  • 00:13:31 - ブロッコリースプラウトホモジネートは、上気道の抗酸化酵素を増加させます。
  • 00:15:45 - 十字架植物の消費と心臓病の死亡。
  • 00:16:55 - ブロッコリー発芽粉は、2型糖尿病患者の血中脂質および心臓病のリスクを改善します。
  • 00:19:04 - の始まり 高齢化 の項目を検索します。
  • 00:19:21 - Sulforaphane強化ダイエット 寿命 15から30%へのカブトムシ類(特定の条件において)。
  • 00:20:34 - 長寿のための低炎症の重要性。
  • 00:22:05 - 十字架野菜やブロッコリーの発芽粉は、人間の広範な炎症マーカーを減少させるようです。
  • 00:23:40 - 中途半端なビデオ要約:がん、エイジングセクション
  • 00:24:14 - マウス研究は、スルホラファンが老年期の適応免疫機能を改善する可能性があることを示唆している。
  • 00:25:18 - スルフォラファンは、脱毛のマウスモデルで毛の成長を改善しました。 画像 00:26:10。
  • 00:26:30 - 脳と行動セクションの始まり。
  • 00:27:18 - ブロッコリースプラウト抽出物が自閉症に及ぼす影響。
  • 00:27:48 - 統合失調症に対するグルコラファファインの効果。
  • 00:28:17 - うつ病訴訟の開始(その可能性のあるメカニズムと研究)。
  • 00:31:21 - 10の異なるストレス誘発うつ病モデルを用いたマウス研究は、フルオキセチンと同様に有効なスルフォラファンを示すプロザック).
  • 00:32:00 - マウスにおけるグルコラファファインの直接摂取が、社会的敗北ストレスモデルからのうつ病の予防において同様に効果的であることを示す研究。
  • 00:33:01 - 神経変性セクションの始まり。
  • 00:33:30 - スルフォラファンおよびアルツハイマー病。
  • 00:33:44 - スルフォラファンとパーキンソン病。
  • 00:33:51 - スルフォラファンとハンチントン病。
  • 00:34:13 - Sulforaphaneは熱ショックタンパク質を増加させます。
  • 00:34:43 - 外傷性脳傷害のセクションの始まり。
  • 00:35:01 - TBIの直後に注射されたスルフォラファンは記憶を改善する(マウス研究)。
  • 00:35:55 - Sulforaphaneとニューロンの可塑性。
  • 00:36:32 - Sulforaphaneは学習を改善します モデル マウスのII型糖尿病の診断。
  • 00:37:19 - スルフォラファンおよび デュシェンヌ 筋ジストロフィー。
  • 00:37:44 - 筋肉衛星細胞のミオスタチン阻害(インビトロ)。
  • 00:38:06 - 死亡率と癌、DNA損傷、酸化ストレスと炎症、ベンゼン排泄、心血管疾患、II型糖尿病、脳への影響(うつ病、自閉症、統合失調症、神経変性)、NRF2経路。
  • 00:40:27 - ブロッコリーの芽またはスルフォラファンの量を計算することについての考え方。
  • 00:41:01 - 自宅での発芽に関する逸話。
  • 00:43:14 - 調理温度とスルフォラファンの活性について。
  • 00:43:45 - グルコラファファインからのスルフォラファンの腸内細菌転換。
  • 00:44:24 - サプリメントは野菜からの活性ミロシナーゼと併用するとより効果的です。
  • 00:44:56 - 料理技術と十字架野菜。
  • 00:46:06 - 甲状腺ホルモンとしてのイソチオシアネート。

謝辞

Sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231716302750

スルフォラファンはどのように生産されていますか?

加熱によりエピチオ化剤のタンパク質活性が低下し、ブロッコリーのスルフォラファン形成が増加する

抽象

ブドウ糖由来のイソチオシアネートであるスルフォラファン(Sulforaphane)は、最も強力な食品由来抗癌物質の1つです。 この化合物は無傷の植物には存在せず、むしろブロッコリー組織を粉砕または咀嚼したとき、ミロシナーゼ、チオグルコシダーゼ酵素の作用によりグルコシノラート前駆体、グルコラファファインから形成される。 しかし、多くの研究により、グルコラファファインからのスルフォラファン収率は、 低く、 植物組織が室温で粉砕された場合、非生物活性ニトリル類似体であるスルフォラファンニトリルが一次加水分解生成物であることを示している。 最近の証拠は、シロイヌナズナにおいて、グルコシノレートからのニトリル形成が熱感受性タンパク質によって制御され、 エピサイクロファイター ミロシナーゼの非触媒的補因子であるタンパク質(ESP)である。 我々の目的は、ブロッコリーにESP活性が含まれているかどうかを判定し、ESP活性、スルフォラファン含量および生物活性の熱依存性変化を相関させるために、スルフォラファンおよびスルフォラファンニトリル形成に対する加熱ブロッコリーの小花および芽の効果を調べることであった。細胞培養における第2相解毒酵素キノンレダクターゼ(QR) 均質化の前に新鮮なブロッコリー小花またはブロッコリーの芽を60°Cに加熱すると、同時にスルホラファンの形成が増加し、スルフォラファンのニトリルの形成が減少した。 ESP活性の有意な損失は、スルフォラファンニトリル形成の減少と平行していた。 70℃以上に加熱すると、ブロッコリー小花の両方の生成物が減少したが、ブロッコリーの芽は減少しなかった。 培養マウス肝癌Hepa lclc7細胞におけるQRの誘導は、スルフォラファン形成の増加と並行して起こった。

60°Cへのブロッコリー小花や芽の予熱は、粉砕後の植物組織抽出物中のミロシナーゼ触媒によるスルホラファン(SF)形成を有意に増加させた。 これは、スルフォラファンニトリル(SFニトリル)形成およびエピチオスペシファータンパク質(ESP)活性の低下に関連していた。

キーワード: ブロッコリー、アブラナ科、アブラナ科、癌、抗カルシノーゲン、スルフォラファン、スルフォラファンニトリル、エピチオスペシファータンパク質、キノンレダクターゼ

結論として、スルフォラファンは、 ブロッコリ、その他のアブラナ科野菜。 内的および外的要因の両方によって引き起こされる制御されない量の酸化剤は、人体に酸化的ストレスを引き起こし、最終的に様々な健康問題につながる可能性がある。 Sulforaphaneは、Nrf2の生産を活性化することができます。NrfXNUMXは、酸化防止剤に対する細胞の反応を制御する防御的な抗酸化メカニズムを制御する転写因子です。 私たちの情報の範囲は、カイロプラクティックと脊髄の健康問題に限られています。 主題について話し合うには、ジェメネス博士にお気軽にお問い合わせください。 915-850-0900 .

アレックス・ヒメネス博士によるキュレーション

参照元: Sciencedirect.com

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背中の痛み 障害の最も一般的な原因の1つであり、世界中の仕事で欠場しています。 背部の痛みは、医者の診察の2番目に一般的な理由であり、上気道感染症の数だけ多い。 人口のおよそ80%は、一生を通して少なくとも1回は腰痛を経験するでしょう。 脊椎は、他の軟部組織の中で骨、関節、靭帯、および筋肉からなる複雑な構造である。 このため、怪我および/または悪化した状態、例えば 椎間板ヘルニア最終的には、背痛の症状につながる可能性があります。 スポーツ傷害または自動車事故による傷害は、多くの場合、背痛の最も頻繁な原因であるが、時には最も単純な運動は痛い結果をもたらすことがある。 幸運なことに、カイロプラクティックケアのような代替治療の選択肢は、脊柱調節と手作業による腰痛の緩和に役立ち、究極的には疼痛緩和を改善する。

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